3D打印技术制备生物医用高分子材料的研究进展

新加坡南洋理工大学的Hutmater等使用PCL为原料，通过FDM技术制备了蜂窝状、内部完全贯通的可降解3D组织工程支架，材料的通道尺寸为160～700μm，孔隙 率为48%～77%．材料的压缩硬度可从4～77MPa范围内变化，而屈服强度为0.4～3.6MPa，屈服应变为4%～28%．材料的孔隙率与压缩性质具有高度的相关性．人初级成纤维细胞与材料共培养后， 3～4周后发现细胞完全充满支架的空隙．当将表面含有骨髓间充质细胞的3D支架移植到猪眼眶的创口后，获得比没有支架材料或没有种植细胞的支架更好的新骨形成效果  ．南洋 理工大学的Teoh等以PCL为原料，利用FDM技术制备了骨软骨复合支架，并将成骨细胞与软骨细胞分别种植于支架的两部分。
 

2种细胞在支 架中分泌出不同的细胞外基质，在成骨细胞种植区出现了较高的骨钙，而软骨细胞种植区测得了较高的碱性磷酸酶．该结果表明，这种3D打印的PCL支架可望应用于骨软骨修复方面． 荷兰乌特勒支药学研究所Hennink等使用苄基保护的羟甲基乙交酯（BMG）与己内酯（ε-CL）共聚，然后再进行苄基脱保护，获得了羟甲基乙交酯（HMG）与ε-CL的共聚物（PHMGCL），并通过纤维熔体沉积技术制备了3D支架．侧链羟 基的引入增加了材料的亲水性和降解速率，并增强了细胞对材料的黏附， 促进了人间充质干细胞的存活和增值， 以及成骨分化．PHMGCl（HMG∶Cl=8∶92）3D支架经皮下移植到Balb/c鼠体内后，PHMGCl支架在3个月内重量损失达到60%，PHMGCl的分子量也出现了明显的降低，而PCL支架则没有出现明显的重量损失．另外， 材料移植到鼠体内后引起了温和的炎性反应，局部出现了巨噬细胞、淋巴细胞和纤维化．在动物皮下，PHMGCl支架比PCL支架具有较高的血管生成效果． 韩国浦项科技大学的Cho等以PCL/PLGA为原料，使用一种多头沉积技术，制备了复合3D支架  ．材料具有600μm的孔径和69.6%的孔 隙率，压缩强度和模量分别为0.8和12.9MPa，材料在细胞实验过程中能够维持初始结构．另外，多头沉积技术还能有效地在3D支架中填充入水凝胶， 而水凝胶可以作为生长因子或细胞的理想载体载入3D支架中  ．经过贻贝黏附肽（尤其是结合RGD后）修饰的PCL/PLGA三维支架能提高人脂肪衍生干细胞的黏附、增值和成骨分化，并促进动物体内颅骨缺损部位的骨再生 。
 

另 外， 聚（L-丙交酯-ε-己内酯）（PLLACL）无规共聚物也被用于3D纤维沉积技术制备生物降解支架 ． 其他聚酯材料也被用于FDM技术制备可降解支架材料．荷兰屯特大学的Woodfield等以生物可降解的聚乙二醇-对苯二甲酸酯/聚对苯二甲酸丁二醇酯（PEGT/PBT）嵌段共聚物为原料，以6月大的新西兰白兔股骨远端和胫骨近端关节的三维CT成像数据为模型，利用3D纤维沉积技术分别制备了兔股骨和胫骨修复支架， 并将从兔自身提取的软骨在支架上培养一段时间后，移植到兔的关节缺损部位进行原位关节修复 ．移植6周后，支架分别与股骨和胫骨结合，然而，形成的纤维软骨状组织， 还没有达到移植软骨的效果，
     聚酯与无机粒子的复合物也能用于熔融沉积成型制备3D支架材料．在原料中加入20%的磷酸三钙（TCP）后，能促进人间充质干细胞（hMSCs）的增殖与成骨分化．当载有hMSCs细胞的PCL-TCP支架移植到裸鼠股骨缺损部位后，hMSCs能在移植3周后保持存活，然而，只有50%的股骨缺损部位有新骨生成．在PCL-TCP三维支架中载入15%的庆大霉素（PT15）后，能有效地在2h内消除细菌，而且没有出现明显毒性  ．当使用PT15来处理感染的鼠全层伤口时， 也能有效地消除创口的细菌．另外， PT15处理的实验组没有出现明显的整体感染，能有效地促进伤口愈合．PLGA/TCP复合3D支架移植到兔股骨缺损部位12周后，表现了良好的骨诱导性能，并且材料逐渐降解  ．然而，进一步在支架表面添 加羟基磷灰石组分并没有对材料的降解与骨形成产生显著影响．另外，同时载有成骨细胞与人脐静脉内皮细胞的PCL/PLGA/TCP复合3D支架在移植到鼠颅骨缺损12周后， 同时载有两种细胞的3D支架比只载有一种细胞的支架具有更好的促新骨形成效果  ．
选择性激光烧结 
    选择性激光烧结（SLS）是采用激光束按照计 算机指定路径扫描，使工作台上的粉末原料熔融、粘结固化．当一层扫描完毕，移动工作台，使固化层表面铺上新的粉末原料， 经过逐层扫描粘结，获得三维材料．与SLA技术通过紫外光逐层引发液态树脂原料发生聚合或交联反应不同，SLS技术是通过激光产生高温使粉末原料表面熔融、相互粘结来形成三维材料．SLS技术常用的原料包括塑料、 陶瓷、金属粉末等．其优点是加工速度快，且无需使用支撑材料，但缺点是成型产品表面较粗糙，需后处理，加工过程中会产生粉尘和有毒气体，而且持续高温可能造成高分子材料的降解，以及生物活性分子的变形或细胞的凋亡，该技术不能用于制备水凝胶支架．以生物可降解高分子为原料， 利用SLS技术，也是制备外部形态和内部结构可控3D医用高分子材料的有效途径。
 
       对支架性能产生影响的主要参数包括颗粒尺寸、激光能量、激光扫描速率、部分床层温度等 美国密歇根大学的Das等使用PCL为原料，通过SLS技术制备了3D可降解多孔支架，支架材料的压缩模量和屈服强度分别为52～67MPa和2.0～3.2MPa，该结果达到或接近了人松质骨力学性质范围  ．获得的3D支架材料能与动物 骨组织良好的结合，具有良好的生物相容性．按照猪的下颌髁突原型， 制备了PCL下颌髁突支架．使用NaCl等致孔剂，可获得具有高孔隙率的3D支架材料 ．通过在原料中加入80wt%的NaCl， 可以获得孔隙率高达90%的3D支架材料，并形成了约1mm的内部通道结构．经过实验后处理，99.99%的致孔剂可以被浸提出来．降低激光源能量，可获得具有较低压缩硬度的成型材料  ．较 低力学强度的支架材料可以用于某些软组织工程修复（如心脏组织工程等）．将C2C12成肌细胞与压缩硬度为345kPa的PCL三维支架共同培养21天后，发现细胞分布于支架的整个区域，培养11天后，观察到C2C12的融合和分化．SLS技术制备的PCL三维支架也可以用于药物控制释放的载体。
 
      以亚甲基蓝为模型药物，与PCL制备 成含有多层同心环结构的圆柱型药物控制释放器件，聚合物和亚甲基蓝均一分布于基质中，且初期突释行为可以通过增加同心环的数目而降低，模型药物从该器件中主要以扩散机理释放．另外，由于SLS技术操作过程中会产生高温，因此为了减少可降解高分子原料（如PCL、 PLA等）在加工过程中发生降解，或造成原料中的生物活性分子变 性， 开发了一种表面SLS技术 ．该技术可以控制烧结过程中只融化颗粒的表层原料． 通过制备聚酯与纳米羟基磷灰石（HA）的复合微球，或直接将聚酯粉末与HA粉末共混，通过SLS技术烧结，可以获得聚酯/HA的3D复合材料 ．南洋理工大学的Wiria等利用SLS技术， 将尺寸为125～250μm的PLGA（95/5）和HA或HA/TCP混合粉末烧结，制备了人第四中节指骨支架模型 ．香港大学Wang等以聚（羟基丁酸 酯-羟基戊酸酯）（PHBV）/磷酸钙（Ca-P）纳米复合微球为原料，制备了人近端股骨髁3D多孔支架  ．并通过对支架材料使用明胶/肝素进行表 面修饰，并载入重组人骨形成蛋白-2（rhBMP-2），显著促进了的细胞的碱性磷酸酶活性和成骨分化． 除了以生物可降解聚酯为原料，也可以使用生物相容的非生物降解高分子为原料（例如聚醚醚酮（PEEK）、聚乙烯醇、高分子量聚乙烯、尼龙-6等）  ，以及它们与HA的复合材料 ， 通过SLS技术，制备可以适合于临床使用的个性化假肢等骨修复或骨替代材料.
3D喷印 
3D喷印（3DP）技术是在基底表面铺上薄层 粉末原料，然后通过计算机CAD模型控制喷头按照指定路径将液态粘结剂喷在粉末的设定区域，该层粉末粘结后上下移动操作台，并在粘结层表面铺上新的薄层粉末， 通过逐层粘结，最后除去未粘结的粉末原料， 获得三维原型材料．3DP技术操作简便、产品具有高孔隙率、原料应用范围广，其缺点是产品力学强度较低，产品需进行后处理、只能使用粉末原料等．美国Therics公司的Sherwood等通过3DP技术，制备了上层组分为PLGA/PLLA，下层为PLGA/TCP的软骨-骨复合支架  ．上层软骨支架区的孔隙率为90%，而下层 成骨区孔隙率控制在55%．研究发现软骨细胞更倾向于黏附于支架的软骨支架区，培养6周后可以看到软骨组织的形成．支架的成骨区力学强度可以达到与人新生松质骨同一数量级．该研究为完全关节重建技术提供了一种新的方案．

直接携带细胞打印的生物打印技 术 
直接通过3D打印技术控制细胞在微观尺度 的排列分布， 对于调节细胞行为、细胞间的相互作用、细胞与材料间的相互作用，以及促进细胞最终形成功能组织具有十分重要的意义．另外，相比于在已成型的支架中种植细胞，直接携带细胞打印可以获得更高的细胞密度．因此， 近年来通过直接携带细胞进行3D打印的细胞或组织打印技术受到了广泛的关注．由于水凝胶与天然软组织细胞外基质在结构、 组成和力学性质上的相似性，目前的细胞和组织打印技术主要是基于携带细胞的水凝胶的3D沉积技术  ．对于3D打印成型的携 带细胞水凝胶支架的基本要求包括：
（1）水凝胶在工作台沉积后能快速原位成型，并维持初始沉积的形状；
（2）保持细胞活性和功能；
（3）打印成型的支架容易进行后处理．
    目前一种常用的细胞打印技术是以双键封端的PEG（如PEG-DA或甲基丙烯酸酯封端的PEG（PEG-DMA））水溶液与含有细胞的培养液混合，形成可光固化高分子/细胞混合溶液，然后通过立体印刷技术，打印成型包覆细胞的3D水凝胶 ．为了提高水凝胶骨架与细胞间的相互作 用，可以在原料中引入等生物活性分子修饰的共聚单体．例如，引入RGD修饰的共聚单体 后， 可以明显促进水凝胶内细胞的存活和生长  ．美国斯克里普斯研究所的D’Lima等以天然牛股骨髁制成体外软骨缺损模型，以PEG-DMA/软骨细胞混合溶液为生物墨水，在紫外光照下， 在软骨缺损部位进行原位打印 ．该方法 打印成型的PEG水凝胶的压缩模量与天然关节软骨接近．打印后软骨细胞能在水凝胶支架内均匀分布，而且细胞存活率要比生物墨水先沉积后再进行光照聚合的成型方法高26%．值得注意的是， 打印后支架能与周围的天然组织紧密结合，该性质对于未来体内组织缺损的原位修复非常重要．
     该方法为开发能直接应用于体内的原位生物打印技术，进行组织缺损原位修复提供了一个重要的手段．除了通过上述光聚合反应，其他生物相容的原位凝胶成型技术也被用于3D细胞打印．例如，可以将藻酸盐与细胞的混合溶液打印成型后，再 在CaCl2溶液中浸泡，使得藻酸盐与Ca2+形成稳 定的离子交联网络 ．研究发现，携带人心肌 祖细胞（hCMPCs）的3D生物打印成型的支架，在体外培养1天和7天时，支架内的细胞存活率达92%和89%，hCMPCs能维持原有的功能，而且通过3D支架培养提高了早期心脏转录因子的表达．前期实验结果表明，该技术可望在心脏组织工程中获得应用．另外， 利用凝血的原理，可将含有细胞的凝血酶溶液作为生物墨水，喷入以纤维蛋白原溶液为生物纸的基质中，通过原位凝固形成包裹细胞的纤维蛋白支架 ．而且，纤维蛋白本 身具有促进血管生成的性质，也是骨骼/平滑肌细胞和软骨细胞的理想支架材料．实验证明，该技术打印成型的细胞支架能促进人微血管内皮细胞的增殖和微血管形成．
    此外，胶原也是一种应用广泛的组织工程支架材料．将含有细胞的胶原在较低pH下进行打印后，再在支架表面喷洒碳酸氢钠溶液使体系的pH升高至中性，促使胶原发生自身物理凝胶化， 形成稳定的3D细胞支架．哈佛医学院的Yoo等利用该技术制备了分别含有内部纤维原细胞和外部角质细胞的双层细胞支架，发现两层细胞都维持了高的细胞活性．这种多层细胞 打印技术为将来直接进行更为复杂的组织打印技 术奠定良好的基础．

结论
     以上文章主要总结了近年来3D打印技术应用于 生物医用高分子材料制备方面的研究进展，比较了不同3D打印技术各自的优势和局限性，并对3D成型高分子支架材料在细胞培养或动物模型的组织修复方面的应用进行了讨论．目前常用的几种3D打印技术都具有各自的优势和局限性．光固化立体印刷技术制备的3D材料精度高、力学强度较高， 但在后处理除去有机溶剂等杂质过程中需要避免成型产品发生变形．熔融沉积成型技术制备的成型产品精度高、表面质量好，但是需要高温将原料熔融．选择性激光烧结技术的优势则是加工速度快、无需使用支撑材料，其缺点是高加工温度、成型产品表面粗糙等．另外，3D喷印技术操作简单、 快速成型、制备条件温和，然而，其成型产品的力学强度较低．因此， 在选择不同方法制备三维高分子支架材料时，还需结合原料的特点以及对成型产品的性能要求．
    目前， 3D打印技术在硬组织工程支架材料的制备方面获得了较多的关注和研究进展．然而，总的来说， 3D打印技术在生物医用高分子材料的制备领域仍处于初始阶段．要实现3D打印技术在临床的应用还面临很多挑战．首先对于高分子原料的选择是影响3D成型材料应用的重要因素，其中主要包括高分子的生物相容性、生物响应性、降解性能、力学性质等．此外，在3D打印及后处理过程中需要保持成型材料的生物相容性，以及表面或内部细胞的存活率．最后，需要阐明细胞在3D支架材料内部的黏附、生长和分化的机制，尤其是材料与细胞相互作用的机制．


部分文章来源：3D打印技术制备生物医用高分子材料的研究进展 *（贺超良 汤朝晖 田华雨 陈学思 中国科学院长春应用化学研究所中科院生态环境高分子材料重点实验室 ）