高分辨率熔解HRM的应用前景

　　甲基化分析

　　HRM分析还为DNA甲基化状态的检测另辟蹊径。DNA样品通过亚硫酸氢盐的处理，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。这样，原先未甲基化模板所产生的PCR产物比甲基化模板的Tm要低。HRM还能确定特定样品中甲基化的比例。将不同比例的甲基化和未甲基化DNA混合，制作出标准曲线，将样品的熔解曲线与之相比较，从而确定样品中甲基化的比例。

　　异常的甲基化模式往往与癌症相关联，于是ErciSmith等开发并验证了快速定量DNA甲基化状态的HRM分析5。他们利用数学方法来标准化加热DNA所产生的原始荧光数据，从这些数据中计算出熔解开始和结束的温度，从而反映模板分子的甲基化水平。之后，他们还用已知甲基化水平的寡核苷酸及DNA进行了验证。他们发现，通过HRM分析这种快速单管的方法来定量甲基化是可靠的，引物容易设计，且无需专门的软件。所获得的参数提供了标本中甲基化的客观描述和定量，能用于标本之间的统计学比较。

　　综上，HRM技术应用广泛，操作简单又经济，结果精确且可靠，适合任何实验室使用。市场上有一些专供HRM分析的仪器，不过，那些带有HRM功能的定量PCR仪则更实用。QIAGEN的Rotor-GeneQ(Corbett Rotor-Gene6000)就是全球第一台将实时扩增与HRM分析技术相结合的实时荧光定量分析装置。Rotor-GeneQ的温度均一性为0.01°C，温度分辨率为0.02°C，解决了温度均一性、精确性和分辨率的问题，实现了定量扩增与HRM的合二为一。