高分辨率熔解HRM的应用前景

　　正是凭借这些优势，HRM近年来广泛用于突变扫描、序列配对、基因分型和甲基化分析等应用中。

　　序列配对

　　序列差异分析常用的方法包括单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、测序等，这些方法都需要分离样品，之后进行多步反应，操作繁琐，耗时长，且PCR产物有污染的风险。而HMR在5分钟之内就能完成，无需额外的步骤，也容易开发成高通量筛选，且是唯一的闭管操作，增加了分析的可靠性，这些优势对于分子诊断分析而言，格外重要。

　　在器官移植中，医生通常会检测兄弟姐妹的HLA，以便了解主要组织相容性是否匹配。利用PCR产物的熔解曲线，能快速配对HLA序列。与熔解温度(Tm)不同，那只是熔解曲线上的一个点，高分辨率熔解是分析整个熔解曲线。利用熔解曲线的形状作为指示剂，来显示杂合DNA所形成的异源双链的序列匹配。之后将两个DNA按1：1的比例混合，重新熔解，并将新曲线与原先的曲线进行比较，来验证序列的匹配。如果两个样品的序列不是完全相同的，那么混合后异源双链的熔解曲线形状会改变。

　　瑞典乌普萨拉大学的OlofGidlöf等曾开发出线粒体基因组中两个超变区HVI和HVII的HRM分析，以分辨不同个体的DNA，作为法医鉴定中测序前的预筛选2。研究结果表明，线粒体DNA中HVI和HVII所存在的序列变异确实产生了熔解曲线形状的差异，能辨别不同个体的DNA，这样就能排除不匹配的法医材料，从而节省线粒体DNA测序的时间和费用。另外，与其它技术相比，HRM操作简单，价格低，能同时筛选大量的样本。

　　突变扫描

　　单碱基改变、插入、缺失都能通过HRM来检测。在灵敏度和特异性方面，高分辨率熔解也高于dHPLC在内的传统方法。当变异体为低等位基因片段时，它甚至比DNA测序还灵敏。测序只能检测低至20%的变异体，而HRM能检测的变异体低至2%。而且，测序所花的时间、费用和精力，与HRM是不可同日而语的。

　　对于400bp以下的PCR产物，扫描单碱基变化的灵敏度和特异性皆为100%。对于400到1000bp的PCR产物，灵敏度为96.1%，特异性为99.4%。PCR产物中变异的位置不影响扫描准确性。尽管HRM是为检测杂合体(一个等位基因发生突变)而设计的，但它也能检测纯合体(两个等位基因都有突变)。对于半合子变异体(X连锁或Y染色体)，最好将未知样品与已知野生型的样品混合。

　　LMNA基因的突变会导致多种失调，现在称之为核纤层蛋白综合征。由于待研究的个体颇多，故必须用一种特别灵敏且特异的方法来进行突变扫描。于是，GillesMillat等就开发出适合LMNA突变扫描的HRM分析3。他们同时用了HRM和dHPLC两种方法，对64位患有扩张性心肌病的病人进行筛选。结果表明，凡是dHPLC或直接测序能检测出的基因变异，HRM分析也能轻松鉴定，且速度比dHPLC快2倍，还更为经济。研究人员认为，HRM分析是鉴定LMNA遗传变异的高灵敏、高通量的廉价方法。

　　基因分型

　　传统的基因分型方法不仅耗时费力，还需要购买价格不菲的探针。相比之下，HRM分析则是优势多多，无需扩增和制备，排除了污染的风险;探针的钱也省了;还能检测未知的变异体，这一点探针可无能为力。有了饱和染料，PCR产物全程被标记，因此所有的熔解区域都能检测到。对于同一扩增子内的不同杂合体，通过曲线形状的差异也能区分开。HRM大约能分辨93%的杂合体。大部分纯合体也能通过熔解来分辨，但不是全部。大约有4%的人单碱基变异体有着相同的Tm，且图像对称。在这种情况下，可以将已知的纯合体与未知的纯合体混合，再进行分析。

　　LasseKristensen等曾为参与甲基代谢的关键基因(MTHFR、MTR和DNMT3b)开发出HRM分析，对它们进行基因分型，并在Rotor-gene6000等仪器上进行检测4。他们认为，与基于TaqMan探针的基因分型相比，HRM分析更经济。无需使用探针，分析所需的优化也更少，成功率更高。与焦磷酸测序、SNP芯片等多种技术相比，HRM是最佳选择。