高分辨率熔解HRM的应用前景

　　高分辨率熔解(High-resolution melting，简称HRM)分析是一门新兴的技术。它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面。凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。

　　其实双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代，当时是通过紫外吸收来监测的。分析需要几微克的DNA，而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。后来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔解分析变得流行。样品量因毛细管而缩减至纳克级，且熔解速率更快，达0.1-1.0°C/秒，这样熔解时间缩短至几分钟。当时使用的染料是SYBR®Green I。

　　然而，这种熔解分析只能区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，比如检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其他非特异性的扩增。如果要区分SNP，分辨率还不够。为什么呢?这里有必要先介绍一下饱和染料和非饱和染料。SYBRGreenI就属于非饱和性染料，由于它对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。这样，DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生重排，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降。

　　于是，饱和染料问世了。为什么称为饱和染料呢?因为它们即便在饱和浓度(荧光最大)下，也不会抑制PCR。故高浓度的染料饱和了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发生重排，这样熔解曲线才有了更高的分辨率。目前市场上的饱和染料主要有LCGreen、LC Green Plus、SYTO 9等几种。光有染料还不够，仪器也要相应升级呢。

　　扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。

　　那么什么样的分辨率才是高分辨率呢?根据仪器现有的功能测试，在熔解操作时每摄氏度至少要获得10个数据点，这是对仪器的最低要求。此外，温度均一性也同样重要。如果两孔之间温度相差0.1°C，就很可能导致最终的熔解温度相差0.1°C，这样就无法保证HRM分析结果的准确性。大多数常规定量PCR仪的孔间温度差在0.3-0.5°C，这也决定了它们无法胜任HRM。

　　目前市场上有多个厂家提供HRM分析的仪器，包括IdahoTechnology、Corbett(QIAGEN)、Roche等，有些是专供HRM的仪器，有些则是附带HRM功能的定量PCR仪。HRM的发明者—美国犹他大学医学院的Wittwer实验室曾评估了市场上多台仪器在基因分型和突变扫描上的性能1。他们发现，对于大部分仪器的准确基因分型来说，主要限制在于平板上的空间温度差异(Tm的标准偏差为0.020-0.264°C)。其它差异如数据密度、信噪比和熔解速率，也会影响杂合体的扫描。经过比较发现，空气加热型仪器以及样品温度单独控制的仪器有着更低的Tm标准偏差(0.018-0.065)，而加热块型仪器则在0.092-0.274。

　　在拥有饱和染料和高分辨率仪器之后，HRM分析就可以开始啦。这个过程其实很简单，就是对PCR的扩增子进行加热，温度从50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐解链，在到达熔解温度(Tm)时，DNA链完全分开。在HRM分析的初期，荧光强度很高，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。索取更详细的技术资料涡街流量计

　　果然够简单吧，连探针也无需设计，只要在常规PCR中加一个饱和染料即可。HRM既可以对未知突变进行筛查、扫描，也可以对已知突变进行分析。相对于传统的突变分析而言，操作步骤大大简化，时间和成本也降低了不少。而且样品经PCR扩增后直接进行HRM分析，无需转移，真正实现了闭管操作，降低了污染的风险。